Stefan Wilkening studierte Theologie, bevor er an der Münchner Otto-Falckenberg-Schule seine Schauspielausbildung absolvierte. Danach spielte er an den Münchner Kammerspielen unter Dieter Dorn, am Schauspiel Frankfurt und am Bayerischen Staatsschauspiel.

In Film und Fernsehen ist er in „Tatort“, „Rosenheim Cops“, Kommissarin Lucas“, „Die Chefin“, „Polizeiruf“, „Hubert und Staller“ und in preisgekrönten Kinoproduktionen wie Volker Schlöndorffs „Diplomatie“ und Giulio Ricciarellis „Im Labyrinth des Schweigens“ zu sehen.

Seit 2011 ist Stefan Wilkening als freier Schauspieler, Sprecher und Moderator tätig. Er ist in zahlreichen Hörfunk- und Hörbuchproduktionen zu hören und tritt immer wieder als Rezitator mit unterschiedlichen Live-Programmen auf. 2013 erhielt er den Deutschen Hörbuchpreis für „Ulysses“ von James Joyce.